荧光是一种直接成像方法，使用荧光染料 - 也称为荧光团或探针 - 附着在二抗上。虽然大约80％的研究人员继续使用基于酶的化学发光进行Western印迹，但由于成像和荧光团技术的改进以及更多可用的抗体，荧光成像作为一种优选的方法正在迅速发展。荧光提供了优于传统化学发光的几个优点，包括：1）多重靶蛋白的能力，而不一定需要剥离和重新探测，2）增强的定量检测，以及3）由于稳定性而存档和重新成像印迹的能力。荧光分子。大多数西方方案可以很容易地从化学发光或比色方法改编，但需要进行一些优化。以下是一些技术，以避免使用荧光检测时常见的陷阱。
尽管使用当今的技术可以检测三种蛋白质（或更多），但大多数研究人员将多重化限制在两种蛋白质上。印迹上结合的蛋白质越多，优化就越复杂。因此，建议在同时检测多个目标之前检测每种目标蛋白质。单目标检测有助于在多重分析之前确定每种抗体的条带模式。建议用蓝色通道检测**强的目标蛋白，用绿色通道检测中间目标，用红色通道检测较弱的蛋白质。（膜具有更高的固有荧光和短波长激发（蓝色）。）此外，始终使用来自不同物种的一抗 - 例如小鼠到山羊 - 作为从两个密切相关的物种产生的抗体 - 例如
多重研究中的一个常见问题 - 特别是在蛋白质重量相似并且紧密迁移的翻译后修饰研究中 - 是跨通道荧光或渗透。渗透是指您在拍摄蓝色图像时拍摄乐队，例如拾取Cy3（绿色）频道。为了避免串扰，研究人员应该验证二级抗体与荧光团结合，具有非重叠的发射光谱。在获取图像之前，还需要仔细检查发射滤波器，因为滤波器旨在覆盖特定的带通。
使化学发光方案适应荧光的一个挑战是修改抗体浓度。通常，对于正确的信号，一级抗体浓度应比标准化学发光方案增加二**五倍。然而，极高的抗体浓度也会增加背景噪音。（理想情况下，您需要低背景噪音，这会产生更高的信号背景比。）高抗体浓度也会导致非特异性结合。因此，优化抗体浓度对于获得**佳结果**关重要。试验浓度的简单方法是以各种稀释度为每种抗体孵育膜。二抗也可能需要优化 - 1：5,000稀释是一个很好的起点。
通过化学发光，发射的光的比例与局部酶 - 底物浓度相关。暴露不需要直接光源 - 更多的酶在限时反应中产生更多光。结果，目标信号永远不必与跨膜的自发荧光竞争。（据报道，当使用低蛋白质水平时，化学发光比荧光更敏感的原因之一。）使用荧光检测时，解决这个问题的一个简单方法是用低荧光PVDF膜代替标准PVDF膜。这些膜可增加转移蛋白质的每个通道的信号与背景比，从而产生明亮的清洁条带。为了进一步减少荧光伪影，避免使用墨水标记膜，戴上粉末丁腈手套时不要处理，处理膜时要确保温和。虽然在工作日光条件下光漂白荧光标记的抗体没有风险，但所有荧光标记的抗体库存应该存放在黑暗中。
总之，值得注意的是，所有荧光成像系统都是数字化的。使用荧光成像的乐趣之一是研究人员可以轻松捕获的惊人的出版物图像。虽然数字成像仪的入门价格对于许多实验室而言可能过高 - 数字成像仪的起价大约为30,000美元，高达10万美元 - 此后每次反应的价格与化学发光相比显着下降。随着越来越多的研究人员多路复用并要求更好的线性，用于蛋白质印迹的荧光成像很可能在未来几年成为行业标准。
