固相萃取-超高效液相色谱分离测定洗涤用品中4种荧光增白剂

荧 光 增 白 剂 ( fluorescent whitening agents, FWA) 可以提高基体的白度和保证基体的亮度,在
洗涤用品、纺织品、纸张、涂料和塑料制品中的应用越来越广泛。纺织品在使用过程中会逐渐变黄,而洗涤剂中的荧光增白剂在洗涤过程中吸附在织物纤维上,吸收紫外光后,发射出的蓝紫色荧光补偿了纤维的黄色光,在视觉上认为被洗涤的白色织物洁白、明亮,从而会认为含荧光增白剂的洗涤剂具有更好的洗涤效果。我**允许在衣物洗涤剂中添加二苯乙烯基联苯类( 如 4,4'-双 ( 2-磺酸钠苯乙烯基) 联苯 ( disodium 4,4'-bis ( 2-sulfonatostyryl ) biphenyl, FWA351) 等) 和双三嗪氨基二苯乙烯类( 如 4,4'-双[( 4-苯胺基-6-羟乙基氨基-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐 ( disodium 4,4'-bis
 
[( 4-anilino-6-hydroxyethylami**,3,5-triazin-2-yl ) amino]stilbene-2,2'-disulphonate,FWA85) 、4,4'-双
 
[( 6-苯胺基-4,4'-二羟乙基-氨基-1,3,5-三嗪-2-基)氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐( disodium 4,4'-bis[6-anilino-[4-[bis( 2-hydroxyethyl) amino]-1,3,5-triazin-2-yl ] amino ] stilbene-2, 2'-disulphonate, FWA28) 、4,4'-双[( 4-苯胺基-6-吗啉基-1,3,5-三嗪-2-基) 氨基]二苯乙烯-2,2'-二磺酸二钠盐( disodium 4,4'-bis[( 4-anilino-6-morpholi**,3,5-triazin-2-yl)
amino]stilbene-2,2'-disulphonate,FWA71) 等) 荧光 增白剂,但没有规定**大使用量,也没有相关检测方   法。虽然有资料表明这两类荧光增白剂是低毒 [1,2] ,但也可能因其大量的使用而产生环境污染 的           [3 - 12] ,因此,为了维护消费者权益、监管 和人体危害   洗涤用品质量和评估环境影响,有必要建立洗涤用 品中荧光增白剂的定性定量检测方法。     **内外关于荧光增白剂的检测方法主要有紫外       [13]     [3] 、液相色谱 灯照射观测法   、荧光分光光度法   [4 - 9]       [10 - 12] 。紫外灯照射 法     和液相色谱-串联质谱法   观测法只能检测样品中荧光增白剂的总量,不能鉴 定荧光增白剂的品种; 液相色谱法和液相色谱-串联 质谱法均可应用于荧光增白剂的定性和定量检测, 由于荧光增白剂的含量高,液相色谱法应用更广泛。 文献报道多采用离子对试剂进行色谱分离和荧光检           [6,7] 应用离子对试剂( tetrabutyl- 测器检测,如 Shu 等   ammonium hydrogen sulfate,TBA) -液相色谱 / 荧光检 测器检测洗涤剂和地表水、婴幼儿纺织品和纸张中 87%) 和 FWA71 ( 纯度约为 97%) 由 International
laboratory ( U. S. A) 提供; 其中 FWA28、FWA85 和
的 5 种荧光增白剂,其中包括 FWA28、FWA351 和
; [10,11] (
FWA71 Chen 等 应用离子对试剂 di-n-hexyl-ammonium acetate,DHAA) -液相色谱 / 质谱实现环境水、婴幼儿纺织品和纸张中 5 种荧光增白剂的分离和检测,其中也包括了 FWA28、FWA351 和 FWA71; 练习中等8应用离子对试剂( TBA) -液相色谱 / 荧光检测器检测了食品中的荧光增白剂 ( 包括
 
FWA87、FWA251 和 FWA71) ; 邓凯芬等9应用液相色谱 / 荧光检测器检测纸塑包装中荧光增白剂
 
FWA85。但离子对试剂可与固定相结合产生不可逆吸附,较难从色谱柱上洗脱,缩短了色谱柱的使用寿命; 而且荧光增白剂易受溶剂极性、溶液 pH、光照等因素的影响转变为顺式异构体,荧光消失,导致荧光检测器检测不出顺式结构,只能检测反式异构
 
[3,14 - 16]
体 。
 
本文利用超高效液相色谱-二极管阵列检测器 ( UPLC-DAD) 对洗涤用品中 4 种荧光增白剂( 结构式见图 1) 进行定性和定量研究,并借助超高效液相色谱-质谱 / 质谱( UPLC-MS /MS) 对待测物进行定性确证,表明了 UPLC-DAD 可以实现 4 种荧光增白剂的顺式和反式异构体的良好分离和准确检测,检测结果更能反映样品中待测物的含量情况,可更好地为相关企业和有关监管部门提供检测技术支持。

1  实验部分    
     
         
1. 1  仪器、试剂与材料    
Acquity TM 超高效液相色谱仪,配光电二极管阵
     
列检测器 ( UPLC-PAD,Waters 公司) ;  Acquity TM
     
高效液相色谱和 Waters XevoTM  TQ MS 三重四极杆
串联质谱仪( UPLC-MS /MS,Waters 公司) ;  LD5-2A
离心机( 北京京立离心机有限公司) ;  MS3 basic 漩
涡混合器( 德** IKA 公司) ;  KQ-250DV 型数控超声
 
波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公司) ;  Milli-Q 去
 
离子水发生器( 美** Millipore 公司) ; 固相萃取装置
( Waters 公司) ; Waters Oasis WAX 固相萃取小柱: 3
mL /60 mg,30 μm,临用前依次用 3 mL 甲醇和 3 mL
水活化。        
4 种待测化合物对照品 / 参照品: FWA351( 纯度
> 98. 0%) 由 TCI( 梯希爱) 公司提供; FWA28 ( 纯度
 
约为76 %) 由 Sigma 公司提供 ; FWA85 ( 纯度约为
         
FWA71 的纯度是通过液相色谱分离后,以归一法计算得到。甲醇和乙腈( HPLC 级,德** Merck 公司) 

乙酸铵 ( HPLC 级,Sigma 公司 ) ,甲酸 ( HPLC 级,
 
CNW 公司) ,氨水( AR,含量为 25%,广州) ,超纯水 ( 18. 2 MΩ·cm) 。10 个洗衣液样品、5 个洗衣粉样品均购于本地市场。
1. 2 标准溶液的配制
 
称取各荧光增白剂对照品 / 参照品,用甲醇配制成质量浓度( 按相应纯度折算) 为 5 000 mg /L 的标准贮备液。分别准确移取适量的标准贮备液于 25 mL 棕色容量瓶中,以水配成 FWA28、FWA85 和 FWA71 质量浓度均为 300 mg /L、FWA351 质量浓度为 50 mg /L 的混合标准溶液。以水稀释成 7 个浓度水平的混合标准工作液: FWA28、FWA85 和 FWA71
 
的质量浓度为 0. 3、0. 6、1. 8、9、45、90、180 mg /L;
 
FWA351 的质量浓度为 0. 05、0. 1、0. 3、1. 5、7. 5、15、 30 mg /L。
 
1. 3 仪器条件
 
1. 3. 1 UPLC-PAD 检测条件
 
色谱柱: Phenomenex Synergi Max-RP 柱 ( 150 mm × 2. 0 mm,4 μm,孔径 8 nm) ; 流动相: A. 10 mmol /L 乙酸铵,B. 乙腈。梯度洗脱程序: 0. 0 ~ 8. 0 min,80% A ~ 72% A; 8. 0 ~ 13. 0 min,72% A ~ 62% A; 13. 0 ~ 15. 0 min,62% A ~ 20% A; 15. 0 ~ 18. 0
 
min,20% A;  18. 0 ~ 18. 1 min,20% A ~ 80% A;
 
18. 1 ~ 22. 0 min,80% A。流速: 0. 5 mL /min; 进样
量: 5 μL; 柱温: 25 ℃ ; 检测波长: 350 nm。
1. 3. 2 UPLC-MS /MS 检测条件
 

色谱条件同 1. 3. 1 节。
 
质谱条件: 电喷雾离子源( ESI) ,负离子扫描模式,毛细管电压 1. 0 kV; 离子源温度 150 ℃ ; 去溶剂气温度 500 ℃ ; 去溶剂气: 氮气,800 L /h; 锥孔气: 氮气,50 L /h; 碰撞气: 高纯氩气,0. 2 mL /min; 检测模式: 多反应监测( MRM) 模式; 4 种化合物均选择响
2 -
应**高的[M - 2Na] 为母离子,各监测离子对 ( m /z) 及锥孔电压、碰撞能等参数见表 1,每个离子对的驻留时间均为 0. 04 s。
 
  表 1 4 种待测物的质谱分析条件  
  Table 1  MS parameters for the analysis of the  
    four compounds    
         
Compound Precursor Daughter Cone Collision
ion ( m /z) ion ( m /z) voltage /V energy /eV
 
           
FWA85 413. 3 311 . 0* 40 25
      271 . 2 40 25
FWA28 457. 3 333 . 2* 45 25
      293 . 1 45 30
FWA351 258. 2 226 . 2* 35 20
      194 . 1 35 22
FWA71 439. 3 284 . 3* 40 30
      324 . 2 40 25
             
 
* Transitions for quantification.
 
1. 4 样品的处理
 
称取 0. 5 g( **** 0. 001 g) 试样于 10 mL 具塞比色管中,加入 5 mL 2% ( 体积分数) 甲酸水溶液,涡旋、超声溶解后,用甲醇定容,混匀,以 2 500 r /min 离心 5 min,待净化。
 
吸取 1. 0 mL 提取清液于已活化的 WAX 固相
 

萃取小柱中,自然流出后,依次用 5 mL 25 mmol /L
 
乙酸铵溶液( pH 4) 、3 mL 甲醇淋洗,用 5 mL 5% 氨
 
化甲醇洗脱,接收洗脱液,于 40 ℃ 水浴中氮吹浓缩**干,用 50% ( 体积分数) 甲醇水溶液定容** 1. 0 mL,经聚四氟乙烯( PTFE) 滤膜过滤后测定。
 
2 结果与讨论
 
2. 1  荧光增白剂对照品 / 参照品存在的问题
 
所研究的 4 种待测物均属于二苯乙烯型荧光增白剂,有顺式和反式两种异构体。反式异构体在
 
270 nm 和 349 nm 有明显吸收,其中 349 nm 对应于二苯乙烯分子的共轭体系,270 nm 处是苯胺基团的吸收峰,而顺式异构体在 270 nm 处呈现明显的吸收
 
[14 - 16]
峰,349 nm 处的吸收强度减弱并发生蓝移
FWA351 没有苯胺基团,故只有明显的 349 nm 吸收峰,其顺式异构体的紫外吸收蓝移** 340 nm。
 
由于目前还无法买到纯度高的荧光增白剂标准品,本实验根据液相色谱条件和对应色谱峰的光谱图,结合 UPLC-MS /MS 分析,确定待测物及其顺式和反式异构体,并以归一化法计算相应参照品的纯度,以每种待测物的顺式和反式异构体的 2 个色谱
2. 2  色谱分析条件的优化   KH2 PO4 溶液两种水相对待测物色谱行为的影响。
  对比了 4 根不同的反相色谱柱: 柱 1 为三键键 试验发现: 乙腈比甲醇具有更好的洗脱能力和分离
  合的 Waters Acquity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 效果; 使用 10 mmol /L KH2 PO4  的保留时间比 10
  mm,1. 7 μm) ; 柱 2 为单键键合 C18、内嵌极性酰胺 mmol /L 乙酸铵的保留时间延长,FWA351 的峰形稍
  基团、TMS ( 三甲基硅烷基) 封端的 Waters Acquity 呈拖尾 ( 见图 5 ) 。因此,本实验选用乙腈-10
  UPLC BEH Shield RP18 ( 50 mm × 2. 1 mm,1. 7 mmol /L 乙酸铵为流动相,采用梯度洗脱,液相色谱
  μm) ; 柱 3 为单键键合 C18、TMS 封端的 Phenomenex 图见图 2。    
  Luna C18 ( 2) ( 150 mm × 2. 00 mm,3 μm,孔径 10      
 
nm) ; 柱 4 为单键键合 C12、TMS 封端的 Phenomenex Synergi Max-RP( 150 mm × 2. 00 mm,4 μm,孔径 8 nm) 色谱柱。不同色谱柱的分析谱图见图 4。

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 4  不同色谱柱对 4 种荧光增白剂的分离色谱图的对比
 
Fig. 4 Comparison of chromatograms of the four FWAs on different columns
 
a. Waters Acquity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ,acetonitrile-3% TBA( pH 8) as mobile phase; b. Waters Ac-quity UPLC BEH C18 ( 100 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ; c. Waters Ac-quity UPLC BEH Shield RP18 ( 50 mm × 2. 1 mm,1. 7 μm) ; d. Phenomenex Luna C18( 2) ( 150 mm × 2. 00 mm,3 μm) ; e. Phe-nomenex Synergi Max-RP ( 150 mm × 2. 00 mm,4 μm ) . Mobile phase of b,c,d,e was acetonitrile-10 mmol /L ammonium acetate.
 
The peaks are the same as in Fig. 2.
 
在 4 根色谱柱中,由于 4 种荧光增白剂在水溶液中以阴离子的形式存在,以水作为流动相的水相时,由于待测物的大分子结构的空间位阻在反相色谱柱上呈现弱保留,无法完全分离; 使用阳离子型离
 
子对试剂 TBA 时,增强了待测物与固定相的结合能力,可以较好地分离,但 FWA71 反式异构体的响应很低; 使用 10 mmol /L 乙酸铵-乙腈为流动相时,均可实现分离,但柱 1 的色谱峰顶部分叉,峰形**差,
 
柱 2 和柱 3 的峰形前伸,而柱 4 的峰形**佳,分离度**好。因此,本实验确定选用柱 4( Phenomenex Syn-ergi Max-RP 色谱柱) ,并初步选用乙酸铵或其他盐溶液为流动相的水相。
 
在 Synergi Max-RP 色谱柱上进一步比较了甲醇和乙腈两种有机相、10 mmol /L 乙酸铵和 10 mmol /L
 

 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 5 使用不同流动相时 4 种荧光增白剂在 Synergi Max-RP 色谱柱上的色谱图对比
 
Fig. 5 Comparison of chromatograms of the four FWAs on Synergi Max-RP column with
 
different mobile phases
 
a. methanol-10 mmol /L ammonium acetate; b. acetonitrile-10 mmol /L ammonium acetate; c. acetonitrile-10 mmol /L KH2 PO4 .
 
The peaks are the same as in Fig. 2.
 
2. 3 前处理净化条件的优化
 
考察了 HLB( Waters,3 mL /60 mg) 、MAX( Wa-ters,3 mL /60 mg) 、WAX( Waters,3 mL /60 mg) 和
 
NH2 ( Phenomenex,3 mL /500 mg) 4 种固相萃取柱对
 
待测物的净化回收效果,结果见表 2。
 
4 种待测物均含有磺酸基( -SO3 ) ,酸性强( pKa
 
< 1) ,亲水性强。MAX 固相萃取小柱属于混合型强阴离子交换柱,待测物的磺酸基与柱上的季铵阳离
 
子结合,难以洗脱; HLB 固相萃取小柱属于亲水、亲酯的通用型固相萃取柱,待测物难以与亲水性和亲
 
脂性吸附点紧密结合,净化效果较差; WAX 固相萃取小柱属于混合型弱阴离子交换柱,柱上的哌嗪环与待测物形成离子型吸附,用甲醇淋洗,可有效去除有机杂质,净化效果和回收率良好; NH2 固相萃取小
 
柱上的脂肪族氨丙基在一定 pH 条件下对水溶液中的阴离子选择性吸附,但由于这种伯胺基团的 pKa 大约为 9. 8,需要使用碱性较强的洗脱液 ( pKa ≥ 11. 8) ,使用 12% 氨水甲醇作为洗脱液,氮吹耗时较长,回收不理想,且过柱速度较慢。因此,本实验选用 WAX 固相萃取柱对洗涤用品中的荧光增白剂进
  
行净化处理。
 
表 2 4 种固相萃取小柱对待测物的净化回收率和相对标准偏差( RSD) ( n = 3)
 
Table 2 Purification recoveries and relative standard deviations ( RSDs) of the analytes by four
  SPE columns ( n = 3)       %
             
Analyte       Recovery ( RSD)    
               
  HLB MAX WAX NH2
   
FWA351 62 . 3 ( 11. 2) 0 101 ( 2. 6) 81. 7 ( 9. 1)
FWA85 64 . 4 ( 12. 7) 0 92. 6 ( 4. 3) 89. 5 ( 7. 5)
FWA28 78 . 4 ( 7. 0) 0 94. 9 ( 3. 7) 85. 5 ( 4. 8)
FWA71 78 . 8 ( 8. 4) 0 93. 1 ( 3. 2) 78. 3 ( 5. 9)
                 
 
由于洗衣粉一般呈弱碱性,为了使 WAX 小柱更好地吸附待测物,故选用 2% 甲酸水溶液溶解样品,使样品溶液呈弱酸性,并以甲醇消除洗衣粉溶解时产生的泡沫。
2. 4 线性关系、检出限和定量限
 
按 1. 3. 1 节方法测定 1. 2 节所述的待测物标准溶液系列。FWA351 在 0. 05 ~ 30 mg /L 范围内、
 
FWA85 和 FWA28 在 0. 3 ~ 180  mg /L 范围内、
 
FWA71 在 0. 6 ~ 180 mg /L 范围内与峰面积呈线性关系。各种待测物的线性回归方程、相关系数( r) 、仪器检出限( ILOD,S /N = 3,以纯标准溶液测定) 及方法定量限( MLOQ,S /N = 10,通过在样品基质中加入标准溶液进行前处理后测定,结合样品称样量和稀释倍数计算出来) 见表 3。由表 3 可知: 4 种待测物在各自的线性范围内线性关系良好,相关系数均大于 0. 999; ILOD 为 0. 02 ~ 0. 2 mg /L; MLOQ 为
 
1. 5 ~ 15 mg /kg。
 
表 3 待测物的线性方程、相关系数、仪器检出限和方法定量限
 
Table 3 Regression equations,correlation coefficients ( r) ,the instrument limits of detection ( IL-OD) and the method limit of quantification ( MLOQ) of the analytes
 
Analyte Regression equation r ILOD / MLOQ /
( mg /L) ( mg /kg)
     
             
FWA351 y = 62595x + 995. 14 0. 9997 0 . 02 1 . 5
FWA85 y = 12071x + 1641. 1 0. 9993 0 . 1 8  
FWA28 y = 12406x + 937. 53 0. 9994 0 . 1 8  
FWA71 y = 8236. 6x + 525. 38 0. 9993 0 . 2 15  
             
 
y: peak area; x: mass concentration,mg /L.
 
2. 5 方法回收率与精密度
 
选取不含待测物的阴性洗衣液和洗衣粉样品进行加标回收试验,6 次平行测定的回收试验结果见表 4。不同样品在添加浓度范围内,FWA351、FWA85、FWA28 和 FWA71 的回收率分别为 92. 5%
 
~ 103%、86. 9% ~ 95. 3%、92. 5% ~ 105% 和 84. 9% ~101%,RSD 为 3. 2% ~ 6. 1%。

 
    表 4 回收率和精密度测定结果( n = 6)      
  Table 4 Determination results of recovery and    
      precision ( n = 6)            
               
    Spiked / Liquid laundry Powder laundry
  Analyte   detergent       detergent
  ( mg /kg)          
                     
      Recovery /% RSD /% Recovery /% RSD /%
         
                       
FWA351 5     97 . 4 3. 9 93 . 7 4. 5
    25     98. 8 4. 1 95. 9 4. 3
    250     103   3. 2 92 . 5 3. 6
FWA85 30     86 . 9 5. 1 91 . 3 4. 9
    150     95 . 3 4. 7 94 . 1 5. 2
    1500     92 . 1 4. 3 89 . 4 5. 9
FWA28 30     92 . 5 4. 2 95 . 1 5. 3
    150     96 . 1 4. 9 93 . 8 4. 5
    1500     98 . 6 4. 4 105   6. 1
FWA71 30     89 . 7 4. 9 84 . 9 5. 5
    150     93 . 4 4. 5 91 . 7 4. 3
    1500     101   3. 5 96 . 2 4. 8
    表 5 15 份样品中 4 种荧光增白剂的含量    
  Table 5 Contents of the four fluorescent whitening    
      agents in 15 samples     mg /kg
               
  Sample   No. FWA351 FWA85 FWA28 FWA71
                     
  Liquid   1*   644. 3 400. 6   10.
  detergent   2       4
      3     90. 2  
      4   582. 7  
         
      5      
           
      6      
           
      7   1083  
         
      8      
           
      9      
           
    10      
         
  Powder 11     83. 4 24. 1  
        1544
  detergent 12     19. 0 539. 3 15. 6 19.
    13     22. 1   5
    14     46. 5   2. 7
    15      
           
  *  Baby use; - : not detected.          
             
 
2. 6 实际样品的检测
 
使用本方法测定了本地市场上购买的 10 个洗衣液样品和 5 个洗衣粉样品,检测结果见表 5。表 5
 
的数据表明: 15 个样品中,检出阳性样品 8 个,阳性样品检出率为 53. 3%; 4 种待测物中,FWA351 的检出率**高,为 53. 3%,含量范围为 22. 1 ~ 1 083 mg /kg,表明洗涤用品中较多使用该种荧光增白剂;在样品( 洗衣粉) 12 中,同时检出了 4 种目标物,其液相色谱图见图 6,采用液相色谱-质谱按 1. 3. 2 节
 
方法确证的提取离子色谱图见图 7。
 
3 结论
 
建立了同时测定洗涤用品中 4 种荧光增白剂 ( FWA85、FWA28、FWA351 和 FWA71 ) 的超高效液相色谱-二极管阵列检测方法。洗衣液和洗衣粉样品中的阴离子型荧光增白剂通过 2% 甲酸水溶液溶解,甲醇提取,WAX 固相萃取小柱净化,获得较好的
 

.
.净化效果; 采用 Synergi Max-RP 色谱柱,以乙腈-10 mmol /L 乙酸铵进行梯度洗脱,获得良好的分离度 ( 包括顺式和反式异构体) ,根据保留时间和光谱图定性,标准工作曲线定量。通过对方法回收率、精密
 

度等方法学技术指标的研究,表明方法具有较高的回收率和精密度,且方法的前处理简单,可为定性和定量分析洗涤用品中荧光增白剂( 包括顺式和反式异构体) 提供一种准确有效的检测方法。