液相色谱-高分辨飞行时间质谱法测定食品接触纸包装材料中的7种荧光增

1 引 言
 
荧光增白剂( Fluorescent whitening agents,FWA) 是一种荧光染料,常被用于纸、塑料等行业的生产中,以提高产品的白度和艳度。鉴于荧光增白剂可能通过食品包装迁移到食品,被人体吸收后会对人体造成危害,各**对荧光增白剂进行了监管,制定了允许用于生产食品接触材料的荧光增白剂清单,如欧盟 2002 /72 /EC1列出了 FWA 393,FWA 184,FWA 236 和 FWA 368 等塑料用荧光增白剂,并明确规定
[2];
食品包装纸**终产品的荧光增白剂的限制为“检测不到该物质迁移到食品中的量” 我**列出了
 
FWA 393,FWA 184 和 FWA 236 3 种塑料用荧光增白剂3,同时规定纸包装产品“生产过程中不得使
[4]
用荧光增白剂” 。因此 建立食品接触纸包装材料中荧光增白剂的快速定性与定量检测方法 有利于对可能存在的违禁添加荧光增白剂行为进行监管。
 
目前,常用的荧光增白剂的检测方法有紫外灯照射观测法( ULO) 5、薄层层析法( TLC) 6、液相色谱法( HPLC) 67和液相色谱串联三重四级杆质谱法( LC-MS /MS) 78等。ULO、TLC 和 HPLC 的方法灵敏度和选择性较差; LC-MS /MS 采用 MRM 模式检测,灵敏度高,抗干扰能力强,但仍受分辨率、扫描速率和模式的限制,不能满足快速筛查的需求。高效液相色谱串联高分辨飞行时间质谱( LC-TRIPLE-TOF)
[9 ~ 11],
不仅具备了高分辨飞行时间质谱能测得化合物及其碎片离子的分子式和**分子量数据的特性
 
同时具备完全定性、同时定性定量、完全定量 3 种( Triple) 工作流程,在 LC-TRIPLE-TOF 的 TOF MS 触
 
发 TOF MS /MS 的模式下检测,可以根据保留时间、一级离子质量准确度、一级离子同位素分布、二级碎
 
片与谱库匹配 4 [12] 。目前尚未见应
种手段准确定性,具有高分辨率、高灵敏度和高扫描速度等特点
用 LC-TRIPLE-TOF 分析荧光增白剂的报道。
 
本研究采用液相色谱串联高分辨飞行时间质谱技术,以食品接触纸包装材料中 FWA368,FWA367,FWA185,FWA184,FWA52,FWA135 和 FWA393( 结构图见表 1) 7 种荧光增白剂为研究对象,建立了 7 种荧光增白剂的 MS /MS 数据库,并通过优化前处理方法和色谱质谱条件,建立了食品接触纸质包装材料中荧光增白剂的定性确证及定量检测方法。
 
2 实验部分
 
2. 1  仪器与试剂
 
TRIPLE TOF 4600 高分辨质谱仪( 美** AB SCIEX 公司) ; SHIMADZU-30A 高效液相色谱仪系统,包括二元高压泵、自动进样器、柱温箱 ( 日本 Shimadzu 公司) ; MS3 basic 漩涡混合器 ( 德** IKA 公司) ;
 
KQ-250DV 型数控超声波清洗仪( 昆山市超声仪器有限公司 ) ; Milli-Q 去离子水发生器 ( 美**
 
Millipore 公司) 。
 
7 种荧光增白剂标准品: FWA 368,FWA 367,FWA 184,FWA 52 和 FWA 393( 梯希爱( 上海) 化成工业发展有限公司) ; FWA 185 和 FWA 135 ( Internatioanal laboratory U. S. A) 均购于安谱公司; 甲醇 ( HPLC 级,德** Merck 公司) ; 甲酸( HPLC 级,德** CNW 公司) ; 三氯甲烷( 分析纯,广州) ; 超纯水 ( 18. 2 MΩ cm) 。
 
检测样品为各种纸质食品包装材料,包括纸杯、纸巾、纸质蛋糕托、纸盒等共 13 个,购于广州市场。
 
2. 2 标准溶液的配制
 
准确称取各标准品,用三氯甲烷配成 100 mg /L 的单标标准贮备液,再用三氯甲烷-甲醇( 1∶ 9,V /V) 配成 7 种荧光增白剂的混合标准贮备液和所需浓度的标准工作液,!20 ℃ 保存。
2. 3 样品的处理和加标样品的处理
 
用适当的工具将样品剪成约 5 mm ×5 mm 大小,混合均匀,制样过程中注意防止污染。
 
样品处理: 准确称取 1. 0 g( **** 0. 001 g) 试样于 25 mL 具塞比色管中,加入 20 mL 三氯甲烷,超声提取 30 min,取出放**室温后,定容。取 10 mL 提取液于 15 mL 氮吹管中,于 40 ℃ 水浴中氮吹浓缩**干,用三氯甲烷-甲醇( 1∶ 9,V /V) 定容** 1. 0 mL,过 0. 22 μm 有机滤膜,待 LC-Triple TOF MS 测定。
 
加标样品处理: 准确称取 1. 0 g( **** 0. 001 g) 阴性试样于 25 mL 具塞比色管中,加入合适浓度的混合标准溶液,让样品吸取标液并室温放置**干后按上述样品处理。
2. 4 色谱和质谱条件
 
Phenomenex Kinetex C18 色谱柱( 100 mm×2. 1 mm i. d. ,2. 6 μm) ; 流动相: A 为甲醇,B 为 0. 1 甲酸,梯度洗脱: 0. 0 ~ 4. 0 min,60% ~ 100% A; 4. 0 ~ 10. 0 min,100% A; 10. 0 ~ 10. 1 min,100% ~ 60%
A; 10. 1 ~ 14. 0 min,60% A; 流速: 0. 4 mL /min; 柱温: 40℃ ; 进样量: 10 μL。
 
质谱条件: ESI 正模式,电离电压( IS) 5500 V; 雾化气( GAS1) 382 kPa; 辅助加热气( GAS2) 382 kPa; 辅助加热气温度( TEM) 550 ℃ ; 检测模式: 飞行时间全扫描质谱和二级质谱( TOF MS IDA MS-MS) 模式;
TOF-MS 扫描范围为 m /z 100 ~ 1000,TOF-MS 触发二级扫描范围 m /z 100 ~ 1000; 去簇电压 ( DP ) 80 V; MS-MS 碰撞能量( CE) 35 eV; 扩展碰撞能量( CES) 15 eV。
 
在上述条件下获得的二级质谱谱图,建立 7 种荧光增白剂的 MS /MS 数据库,包括分子式、相对分子
 
质量、CAS 编号、化学名及结构图等。
 
2. 5 定性筛查与定量检测
 
应用软件中的 XIC Manger 功能处理采集的数据,根据保留时间和质量准确度( 表 1) ,同位素分布,以及谱库检索进行定性分析; 以提取一级母离子的峰面积进行定量分析。
 
3 结果与讨论
 
3. 1  前处理条件的优化
 对比了甲醇、乙醇、三氯甲烷、二氯甲烷、甲苯、二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、四氢呋喃等有机溶剂,发现 FWA52 和 FWA184 在甲醇和乙醇中有较好的溶解度,而其余 5 种在三氯甲烷中的溶解度**好。基于此 ,实验考察了提取溶剂为氯仿,以及氯仿与甲醇混合溶液( 比例分别为1 ∶ 1 ,1 ∶ 2 ,1 ∶ 3 ,1 ∶ 4 和1 ∶ 5 ,
 


3. 2 色谱和质谱条件的选择
 
7 种待研究 FWAs 在 ESI+ 模式下均得到[M +H]+ 的准分子离子峰,在流动相中加入甲酸能增加
 
FWAs 的离子化效率。考察了乙腈-0. 1% 甲酸和甲醇-0. 1% 甲酸流动相体系对 7 种待研究 FWAs 的色谱行为和离子化程度。结果表明,当流动相为甲醇-0. 1% 甲酸时,7 种待研究 FWAs 的仪器响应值均高于乙腈-0. 1% 甲酸为流动相时的响应值。故本实验选择甲醇-0. 1% 甲酸水作为流动相,并对梯度洗脱程序进行了优化,可以在 5. 5 min 内完成 7 种化合物的分析。
 
应用 TRIPLE-TOF IDA MS-MS 检测,可以采用库检索或手工谱图解析的方法处理数据。为了实现对未知物的谱库筛查或推测结构,以及实现对已知目标物的谱库检索定性,所获得的高质量区和低质量区的质谱碎片都非常重要。因此,根据 7 种待研究 FWAs 的结构性质和仪器响应情况,经优化实验条件,设置二级质谱的碰撞能量( CE) 为 35 eV、扩展碰撞能量( CES) 为 15 eV 时,对于每一种化合物均可获得一张由不同碰撞能( 20,35 和 50 eV) 质谱图叠加的数据质量较佳的 MS2 图。低碰撞能有利于判断主要碎片,高碰撞能可看到更多信息,有效实现准确的谱库检索。
 
3. 3 质谱的定性与定量分析
 
根据本实验获得的 7 种荧光增白剂的一级高分辨质谱图( 均为[M+H]+ ) ,以及提取一级母离子得到的提取离子流色谱图( 图 2) ,得到 7 种荧光增白剂的分子母离子的测定值与理论值、质量**度和保留时间( 表 1) ,7 种化合物的质量偏差的**值在 0. 1×10!6 ~ 1. 3 ×10!6 之间,远小于 3. 0 ×10!6 ,均符合欧盟指令 2002 /657 /EC 的定性确证准则,根据保留时间与**质量可实现对待测荧光增白剂的准确定性; 同时,还获得了 7 种荧光增白剂的二级高分辨质谱图( 图 3) ,谱图含有明显的主要特征碎片,据此建立了这 7 种化合物的标准谱库,在实际样品检测时可通过谱库匹配检索进行筛查,也有助于进一步的定性确证分析。在进行未知物筛查时,高精度的质量数、同位素峰分布以及特征碎片离子,可有效减少可能的分子式组成数,有利于推测化合物的分子式或结构,提高筛查效率,甚**能够实现在没有标准品的情况下对样品中未知的荧光增白剂进行筛查确证。通过进一步收集荧光增白剂标准物质,逐步完善荧光增白剂的液质质谱库,为今后形成标准化质谱库提供支持,为开展筛查和评估食品及食品接触材料中荧光增白剂的安全风险水平提供有力的技术支撑。
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 2 7 种 FWAs 标准溶液( 200 μg /L) 的提取离子流色谱图
Fig. 2 Extracted chromatograms of seven FWAs standards ( 200 μg /L)
 
定量时,使用宽度为 0. 02 Da 的窗口提取一级母离子形成提取离子流色谱图( 如图 2 所示) ,以提取离子色谱峰的峰面积进行定量。由于 TRIPLE TOF 的第三个分析器是具有高分辨率的 TOF,因此具有
 
实现**质量定量的性能。
 
3. 4 线性范围和检出限
 
配制质量浓度为 4,8,16,80,160,280 和 400 μg /L 的 7 种荧光增白剂系列混合标准溶液,在优化的实验条件下测试,以提取目标离子的峰面积 y 对相应的质量浓度 x( μg /L) 进行线性回归,绘制标准曲线,其相关系数均大于 0. 995( 见表 2) ,表明线性关系良好。以定量离子的 3 倍信噪比( S /N = 3) 的响 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 3 7 种 FWAs 标准溶液( 200 μg /L) 的 TOF MS MS 二级质谱图
Fig. 3 TOF-MS-MS spectra of seven FWAs standards ( 200 μg /L)
 
应值对应的化合物浓度作为仪器的检出限 ( LOD) ,以 10 倍信噪比 ( S /N = 10 ) 计算仪器的定量限 ( LOQ) 。7 种荧光增白剂的线性方程、相关系数、检出限和定量限见表 2。
 
表 2 7 种荧光增白剂的线性方程、相关系数、仪器检出限和方法定量限
Table 2 Calibration curve,correlation coefficient,LOD and MLOQ of 7 kinds of FWAs
 
荧光增白剂 线性方程 线性范围 相关系数 检出限 定量限
Linear range LOD LOQ
FWAs Regression equation Correlation coefficients
( μg /L) ( μg /L) ( μg /kg)
     
           
FWA 52 y = 29412x+1345 4 ~ 400 0. 9993 1. 0 10
FWA 135 y = 25306x+3567 4 ~ 400 0. 9995 1. 0 10
FWA 185 y = 21334x+3258 4 ~ 400 0. 9989 1. 0 10
FWA 393 y = 1595x+599 17 ~ 400 0. 9968 5. 0 42
FWA 367 y = 12757x+4089 7 ~ 400 0. 9996 2. 0 17
FWA 368 y = 1880x-409 14 ~ 400 0. 9991 4. 0 35
FWA 184 y = 10130x+4227 4 ~ 400 0. 9997 1. 0 10
           
 
3. 5 回收率和精密度
 
按本实验条件,在阴性样品基质中进行 3 个添加水平的加标回收实验,每个添加水平平行实验 6 次。回收率和精密度结果如表 3,3 个添加水平的平均回收率为 81. 2% ~ 98. 9% ,相对标准偏差为 5. 2% ~ 9. 1% ,表明方法具有良好的精密度和准确度。
 
3. 6 实际样品的测定
 
应用本方法检测了 13 个样品,仅 1 个样品检出含有 FWA184,含量为 287 μg /kg。图 4 显示了阳性样品的提取离子色谱图( XIC) 、母离子质谱图和二级质谱图,使用软件中的 XIC Manager 功能筛查显示其相似度得分为 89. 7,表明具有较高的匹配度,筛查准确率高。
 
本研究建立了基于高效液相色谱串联高分辨质谱( LC-TRIPLE-TOF) 技术的快速筛查和定量检测食品接触纸质材料中 7 种荧光增白剂的分析方法。样品处理简单,使用 TOF MS IDA MS-MS 采集模式,一次进样可以同时获得高质量准确度和高分辨率的一级质谱图和二级质谱图。通过保留时间、质量准确度、同位素分布、MS /MS 数据库进行定性筛查,以提取一级母离子的离子流色谱图进行定量分析,外标法定量,在 5. 5 min 内完成 7 种荧光增白剂的快速分析和鉴定; 同时,方法也可应用于食品接触纸质材料中未知荧光增白剂的筛查,有助于加强非法添加荧光增白剂的监管。
表 3  7 种目标物的方法回收率和精密度( n = 6)            
Table 3  Method recovery and precision for seven FWAs ( n = 6)            
                   
荧光增白剂 添加量 回收率 相对标准偏差   荧光增白剂 添加量 回收率 相对标准偏差
Added Recovery RSD   Added Recovery   RSD
FWA   FWA  
( μg /kg) ( % ) ( % )   ( μg /kg) ( % )   ( % )  
         
                     
  10 86. 1 8. 1     17 84. 9   7. 5
FWA 52 20 93. 5 6. 4   FWA 367 34 85. 9   6. 5
  100 94. 1 9. 0     170 89. 3   5. 2
  10 81. 2 8. 8     35 95. 0   6. 9
FWA 135 20 83. 5 7. 3   FWA 368 70 94. 6   8. 1
  100 84. 8 6. 8     350 96. 8   8. 6
  10 89. 5 7. 0     10 90. 1   7. 9
FWA 185 20 87. 3 8. 9   FWA 184 20 95. 5   8. 4
  100 94. 1 7. 9     100 98. 9   8. 0
  42 94. 3 9. 1              
FWA 393 84 92. 9 8. 6              
  420 95. 6 7. 9              
                     
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
 
图 4 阳性样品中 FWA 184 提取离子色谱图( A) ,母离子质谱图( B) 和二级质谱图( C)
 
Fig. 4 Extracted ion chromatogram ( A) ,MS ( B)  and MS2( C)  of FWA 184 in positive sample