凝胶成像系统对核酸扩增产物的定量检测

随 着聚合酶链反应 P C R ) 的反应试剂 ,
 
仪 器和操作的不断发展和完善 , P C R 扩增产物的量化检验技术逐步趋向于 灵敏特 异 ^, 快
 
速 精确和 自动化.1[ 习 。     但由于定量 P C R 仪器
 
昂贵 ,  成本较高 ,  操作难度大等原因 ,   尚未能
 
普及 和 标准化 。 在常规的实 验室 检测 中 , 对 P C R 产物的分析 , 目前主 要还 是 以琼脂糖电
 
泳 ^,  澳乙 睫 ( E B ) 染色 为主 。     其结果判断主 观
 
性 强 ,  无法 量化检测 ,  在一 定程度上限 制了
 
P C R  技术在临床检验上的应用 . 为此 ,  建立
 
了一种在琼脂糖电泳、  E B 染色的基础上 ,  选
 
择**适 P C R 反应循环 次数 ,  并用 凝胶成 像分
 
析 软件进行分析定量的检测方法 ,  现报告如
 
下 ^:
 
材 料和 方 法
 
一、   检测对象 :
 
1. 标准 血清 ^:   H B V  阳性 血清经定值 标
 
准品 标定并系列稀释为 r 壬10 ~  1 0 6  拷贝 u/  l 。
 
2 . 临床检测标本 : 均来自广州 医学院 第
 
二 附属 医院传染科 。
 
二 、  仪器 :
1·     P C R 仪 :   P E 7 7 0 0  荧_光 定量分析仪 ,
P E 2 4 0 0 P C R _仪 ( P ^e r k i ⁿ E lm e  r  , U S A ) ^。
 
2. 凝胶成像分析仪 :  U V I 图 像分析仪
( U V I一 P R O  ^, B r i t ^a i ⁿ  ) ^,  _{分析软件为} U V I p h ^o -

列为 ^:  5` 一 T G G C T A G T T T A C T A G T G C C A T
 
T T G 一 3, ^。 P C R 检测试剂由中山 医科大学达安公司提 供 , 批号 ” ⁰ 7 70 。 按常规碱裂解法从血清中提 取 H B V 一 D N A ^, 扩增条件为 39 ℃ ² 分钟预变性 , 93 ℃ 45 秒一 5 ℃ 21 ⁰ 秒 , 04
 
个循环。
 
2 . 定性 P C R  检测及凝胶分析定量 :
 
)1 检测 原理 : 用 P C R 荧光定量分析仪实时监测 P C R 扩增曲线 , 并选择合适 的扩增循环次数 ^: 终止 P C R 反应于 “ 平台期效应 ^” 出现
前 ,  同时保证低浓度 模板有足 够量的扩增产
 
物 ,  以使凝 胶分析得 以 测出 ; 选择凝胶分析软
 
件中能客观反映核酸 实际含 量的**适 参数 ^,
 
制定标准曲线 。
 
2) 方法 :  标本处理 、  引物 及扩增条件同定
 
量 P C R 。  循环次数分别选择 04  ,   53  ,  及 23  次。
 
准确吸取扩 增产物 ^s  lu  进行常规琼脂糖电
 
泳 ,  E B 染色 。电泳后将凝胶置于 U V I 暗箱
 
中 ,  用U V l p h o  t ^o   _软件摄像 ^,  用 U V I  b a  ⁿ d  _中
 
的光密度定量软件分析 图像。 选择所需分析条带 , 去除噪 音 ( 干扰 ) , 确定** 适 阂值 , 检测
 
标准梯 度血清扩增条带的体积 ,  面积 ,   高度 ,
 
位置及 体积百分 比等 , 得出标准曲线 , 梯度浓度直方图及相关系数。 用该标准曲线定量待
 
测标本 ,    电脑 打 印实验结 果 ,   同时与 定量
 
P C R 结果对 照 。

t o 及 _{U V l b} a n _d 。
 
三、  检测方法 ^:
 
1. 定量 P C R  检测 川 : 采用 实时 F Q -
 
P C R , 连续检测反应体系中荧光信号 变化 。 以起始模板拷 员数的 自然对 数为横坐 标 , 以循
 
环闭值为纵坐标 , 用阳性梯度标准品制定标准曲线 , 相关系数 r > ⁰ . 89 , 计算标本中起始
D N A  _量。 _引物序列为 :  P l :  5 ^,  一 A T C C T G C T G
 
C T A T G C C T C A T C T T 一 3` <sup>,</sup> P Z <sup>:</sup> 5<sup>`</sup> 一 A C A G T G G G G G A A A G C C C T A C G A A 一 3^` ; 荧光探针 序
 

结 果
 
一 、   梯度标准血清的 P C R实时荧光检测
 
的扩增 曲线 ^:
 
用 实时荧光定量 P C R  连续五次检测梯
 
度 标准血清 ( 1 10 ~  l 护 拷 贝 / lu  ) ,  根据梯度血
 
清荧光信号到达循环阑值时的扩增次数及到
 
达平台期的扩增次数 ( 表 1 ) ^, 选择 P C R 一 凝胶分析定量法 的 ^P C R 扩增次 数分别为 40 , 35
及 3 2 次。

								《上海生 物医学工程 》杂志 2 0 0 0 年第 2																				卷第 4  期
			表		荧光		实时			检测标准血清											拷贝/u  )				与 l			循		环	次数的关系 `								士s
									P C		R									(						P C		R												)
			循环次教			检测 例次																		D N A  含量( 拷贝/ 、							. )
													0						0 2						0					0 盈						0 5						0 6
达闷值之 循环次数										2		7	士	0		7	2		士		0  6		2 7		土 8  5		2 5			士	0			2 2		士	Q			0		士	0		2
																									0
											.				.			.				.		.		.			.			.			.			.		.				.
达平台期之 循环次数										4  7			士 0		.			5 士			0	.	2		士 0	6		0	.	7 土	0			2 7		0 士	0  72				7 士 0				2
												.						.						.		.									.			.		.				.
		二、   不同循环次数凝胶图像分析结果																					次循环时 ,   01					拷贝 / lu					时用琼脂 糖电泳 ,												E B
			.**适循环次数的选择 将梯度标准血																				染色及聚丙酞胺 电泳 ,  硝酸银染色均未能检
	(	0 `		0 `		u	)		l				4 0 ,			3 5		3 2					,										,
清			一		拷贝/												及						出 说明其产物量过低 低于银染检测的灵敏
								分别进 行
次循 环次数的扩增 ,  在琼脂糖 电泳 ,																E B  染色							度。		1 0 2 ~  1 0 6			拷贝 / 。 l 的 5 个梯度的模板 ( 对
后 ,  进行凝胶分析。							结果发现 :				04			及 53			次循						数值 ) 与产物 ( 体积 ) 有良好的线性关系 r(  -
环时 ,			在起始模板考贝数较低时 ( 1 10 一 01 `															拷					0 .     9 7 ) 。  认为 23							次循环线性范围较广 ,												为**适
贝 / Iu			) ,  线 性 良好 ,			而在 01 `  ,   150							及 1。`				拷贝 /						循环次数 ( 图 ) 。
ul  三 个梯度时直线 上 升缓慢 ,											趋于 平坦 ;  32

 
1 4 0 00 0
 
1 20 0 00
 
1 00 0 00
 
^{侧伽呆耸彩} 8 0 0D0 _{A含量 ( Lo  g )}
 

6 0 00 0	积
4 0 0 0 0
2 00 0 0

 
 
 
图 一H B V D N A  含量与光密 度体积的关系
 

	2 .			灵敏度和线性 范围 :   04					及 53  次循环					表 2		D N A 含量与光密度的关系
时 ,  **低可检出 01  拷贝 / lu								起始模板量 ,   其					D N A  含量				光 密 度 ( 3 2  e	y e l e 。  )
线性范围为 110  ~  1 少 拷贝 / uI  ;									23  次循环时 ,				讨考贝数加扮			体积	高度	面积	% 体积
线性范围为 1以~  1护 拷贝 / lt								,	线性范围广			,	1 0 1			1 8 3 0	5	1 3 7		0		15
													1	0	:	7 6 2 3	1 2	5 1 5		0		6 4
适合临床					需要
							。						1 0 3			2 2 5 5 8	4 6	8 3 3		1 .		9 0
	3	.		凝胶分析软 件定量指标的选择 在									1	0	.	峨7 4 1 3	1 1 9	82 3		4   0 0
											:										.
					.				,				1 0 5			8 5 2 3 6	1 6 3	9 4 8		7 .		19
U V I  b a  n d						的光密度定 量分 析指标 中				以体			1	0	`	1 1 6 7 1 6	1 6 8	1 0 0 0		9	.	8 5
积或体积百 分比作为定 量指 标较 好 ,  面 积及
高度等与起 始模板无 明显 相关性 ( 表 2 ) 。																讨	论
	三		、	凝胶定量分析与荧光定量 P C R 结果
的	比较 :												一、   **适循环次数的选择 :
	将		待		测标本同时进行 P C R 一 凝胶定量分
													P C R  反应中 ,				随着扩增反应的不断进
析及荧					定量 P C R 分析 ,  结果有良好的一致
			光										行 ,   目的模板拷贝数以 指数的形式迅速递增。
性	。
													但是 ,   当反应体 系中引物一 模板与 T l(a									酶 -

《上海生 物医学工程》杂志 2 年第 2 盆卷第 4 期