凝胶成像系统对核酸扩增产物的定量检测

随 着聚合酶链反应 P C R ) 的反应试剂 ,
 
仪 器和操作的不断发展和完善 , P C R 扩增产物的量化检验技术逐步趋向于 灵敏特 异 , 快
 
速 **和 自动化.1[ 习 。     但由于定量 P C R 仪器
 
昂贵 ,  成本较高 ,  操作难度大等原因 ,   尚未能
 
普及 和 标准化 。 在常规的实 验室 检测 中 , 对 P C R 产物的分析 , 目前主 要还 是 以琼脂糖电
 
泳 ,  澳乙 睫 ( E B ) 染色 为主 。     其结果判断主 观
 
性 强 ,  无法 量化检测 ,  在一 定程度上限 制了
 
P C R  技术在临床检验上的应用 . 为此 ,  建立
 
了一种在琼脂糖电泳、  E B 染色的基础上 ,  选
 
择**适 P C R 反应循环 次数 ,  并用 凝胶成 像分
 
析 软件进行分析定量的检测方法 ,  现报告如
 
下 :
 
材 料和 方 法
 
一、   检测对象 :
 
1. 标准 血清 :   H B V  阳性 血清经定值 标
 
准品 标定并系列稀释为 r 壬10 ~  1 0 6  拷贝 u/  l 。
 
2 . 临床检测标本 : 均来自广州 医学院 第
 
二 附属 医院传染科 。
 
二 、  仪器 :
1·     P C R 仪 :   P E 7 7 0 0  荧 定量分析仪 ,
P E 2 4 0 0 P C R  ( P e r k i n E lm e  r  , U S A )
 
2. 凝胶成像分析仪 :  U V I 图 像分析仪
( U V I一 P R O  , B r i t a i n  ) ,  分析软 U V I p h o -

列为 :  5` 一 T G G C T A G T T T A C T A G T G C C A T
 
T T G 一 3,  P C R 检测试剂由中山 医科大学达安公司提 供 , 批号 ” 0 7 70 。 按常规碱裂解法从血清中提 取 H B V 一 D N A , 扩增条件为 39 ℃ 2 分钟预变性 , 93 ℃ 45 秒一 5 ℃ 21 0 秒 , 04
 
个循环。
 
2 . 定性 P C R  检测及凝胶分析定量 :
 
)1 检测 原理 : 用 P C R 荧光定量分析仪实时监测 P C R 扩增曲线 , 并选择合适 的扩增循环次数 : 终止 P C R 反应于 “ 平台期效应  出现
前 ,  同时保证低浓度 模板有足 够量的扩增产
 
物 ,  以使凝 胶分析得 以 测出 ; 选择凝胶分析软
 
件中能客观反映核酸 实际含 量的**适 参数 ,
 
制定标准曲线 。
 
2) 方法 :  标本处理 、  引物 及扩增条件同定
 
量 P C R 。  循环次数分别选择 04  ,   53  ,  及 23  次。
 
准确吸取扩 增产物 s  lu  进行常规琼脂糖电
 
泳 ,  E B 染色 。电泳后将凝胶置于 U V I 暗箱
 
中 ,  用U V l p h o  t o   软件摄像 ,  用 U V I  b a  n d  
 
的光密度定量软件分析 图像。 选择所需分析条带 , 去除噪 音 ( 干扰 ) , 确定** 适 阂值 , 检测
 
标准梯 度血清扩增条带的体积 ,  面积 ,   高度 ,
 
位置及 体积百分 比等 , 得出标准曲线 , 梯度浓度直方图及相关系数。 用该标准曲线定量待
 
测标本 ,    电脑 打 印实验结 果 ,   同时与 定量
 
P C R 结果对 照 。

t o 及 U V l b a n d 。
 
三、  检测方法 :
 
1. 定量 P C R  检测 川 : 采用 实时 F Q -
 
P C R , 连续检测反应体系中荧光信号 变化 。 以起始模板拷 员数的 自然对 数为横坐 标 , 以循
 
环闭值为纵坐标 , 用阳性梯度标准品制定标准曲线 , 相关系数 r > 0 . 89 , 计算标本中起始
D N A  引物序列为 :  P l :  5 ,  一 A T C C T G C T G
 
C T A T G C C T C A T C T T 一 3` , P Z : 5` 一 A C A G T G G G G G A A A G C C C T A C G A A 一 3` ; 荧光探针 序
 

结 果
 
一 、   梯度标准血清的 P C R实时荧光检测
 
的扩增 曲线 :
 
用 实时荧光定量 P C R  连续五次检测梯
 
度 标准血清 ( 1 10 ~  l 护 拷 贝 / lu  ) ,  根据梯度血
 
清荧光信号到达循环阑值时的扩增次数及到
 
达平台期的扩增次数 ( 表 1 ) , 选择 P C R 一 凝胶分析定量法 的 P C R 扩增次 数分别为 40 , 35
及 3 2 次。

                《上海生 物医学工程 》杂志 2 0 0 0 年第 2   卷第 4  期                          
        荧光 实时   检测标准血清   拷贝/u  ) 与 l   次数的关系 ` 士s            
                  P C   R                 (           P C   R                     )          
      循环次教   检测 例次                             D N A  含量( 拷贝/ 、 . )                            
              0           0 2         0         0 盈           0 5           0 6      
                                                                             
达闷值之 循环次数         2   7 0   7 2   0  6 2 7   土 8  5 2 5   0     2 2   Q     0 0   2
                                        0                          
                      .     .     .       .   .   .     .     .     .     .   .       .  
达平台期之 循环次数         4  7 士 0 .     5 士 0 . 2   士 0 6   0 . 7 土 0     2 7   0 士 0  72   7 士 0   2
                        .       .       .   .               .     .   .       .  
    二、   不同循环次数凝胶图像分析结果           次循环时 ,   01   拷贝 / lu 时用琼脂 糖电泳 ,   E B
      .**适循环次数的选择 将梯度标准血       染色及聚丙酞胺 电泳 ,  硝酸银染色均未能检
  ( 0 ` 0 `   u )   l       4 0 , 3 5   3 2     ,                   ,                        
                                                               
    拷贝/                             出 说明其产物量过低 低于银染检测的灵敏
          分别进 行                  
次循 环次数的扩增 ,  在琼脂糖 电泳 , E B  染色       度。   1 0 2 ~  1 0 6 拷贝 / 。 l 的 5 个梯度的模板 ( 对
后 ,  进行凝胶分析。 结果发现 : 04   及 53 次循     数值 ) 与产物 ( 体积 ) 有良好的线性关系 r(  -
环时 , 在起始模板考贝数较低时 ( 1 10 一 01 `       0 .     9 7 ) 。  为 23   次循环线性范围较广 ,   为**适
贝 / Iu ) ,  线 性 良好 , 而在 01 `  ,   150      1。` 拷贝 /     循环次数 ( 图 ) 。                                  
ul  三 个梯度时直线 上 升缓慢 , 趋于 平坦 ;  32                                                      
 
1 4 0 00 0
 
1 20 0 00
 
1 00 0 00
 
伽呆 8 0 0D0 A ( Lo  g )
 
6 0 00 0
 
4 0 0 0 0  
2 00 0 0  
 
 
 
图 一H B V D N A  含量与光密 度体积的关系
 
  2 .   灵敏度和线性 范围 :   04 及 53  次循环   表 2 D N A 含量与光密度的关系      
时 ,  **低可检出 01  拷贝 / lu 起始模板量 ,   其 D N A        ( 3 2  e y e l e   )        
线性范围为 110  ~  1 少 拷贝 / uI  ; 23  次循环时 , 讨考贝数加 体积 高度 面积 % 体积
线性范围为 1以~  1护 拷贝 / lt , 线性范围广 , 1 0 1 1 8 3 0 5 1 3 7   0   15
    1 0 : 7 6 2 3 1 2 5 1 5   0   6 4
适合临床 需要                  
          1 0 3 2 2 5 5 8 4 6 8 3 3   1 . 9 0
  3 .   凝胶分析软 件定量指标的选择 在 1 0 . 峨7 4 1 3 1 1 9 82 3   4   0 0
                    :                 .  
          .       ,       1 0 5 8 5 2 3 6 1 6 3 9 4 8   7 . 19
U V I  b a  n d 的光密度定 量分 析指标 中 以体 1 0 ` 1 1 6 7 1 6 1 6 8 1 0 0 0   9 . 8 5
                               
积或体积百 分比作为定 量指 标较 好 ,  面 积及                    
高度等与起 始模板无 明显 相关性 ( 表 2 ) 。                    
  凝胶定量分析与荧光定量 P C R 结果                
                       
比较 :                   一、   **适循环次数的选择 :          
测标本同时进行 P C R 一 凝胶定量分          
  P C R  反应中 , 随着扩增反应的不断进
析及荧 定量 P C R 分析 ,  结果有良好的一致
行 ,   目的模板拷贝数以 指数的形式迅速递增。
                 
                        但是 ,   当反应体 系中引物一 模板与 T l(a     酶 -

《上海生 物医学工程》杂志 2 年第 2 盆卷第 4 期

 
M g Z 十 的 比例达到一定程 度时 ,  酶的催化反应
 
趋 于饱和 ,  此时所扩增 D N A  片段的增 加进
 
入 相对稳定状态 , 即 出现 所谓的 平 台期效应 ” , 将不利于以后 的产物检测 , 其产物的生
 
成量的模板量不呈一 定的相关性 。  因此 ,  有必
 
要对 P C R 的循环次数进行系统分析 , 以选出**适扩增循环次数’.[  ] 。
 
本方法 是将定量标准血清与待测样本同时裂解处理 , 扩增后经 常规琼脂糖 电泳 , E B
 
染色后 , 进行凝胶图像分析 , 根据其光密度体积制定标准曲线。 在实验中既要避免 P C R 反应进入平台期 , 同时又 需保证低浓度模板得
 
到 足够量的扩增产物 ,  以使凝胶图像分析系
 
统 能够 检测并进行分析 。 本实 验通过实时监测 P C R 扩增曲线 , 找出不同拷 贝模板量开始扩增的循 环次数及到达 平台期的循 环次数 ,
 
并根据凝胶染色所能检测 的灵敏度选择 了 23 个循环 。 结果证 明扩增产物 与起始模板 量
 
相关性良好 ,  且 有较广 的测定范 围 ,  有一定的
 
通用性 ,  并在丙型该 眼肝炎 ( H C V 一 R N A ) 和
 
结核 ( T B一 D N A ) 的 P C R 中获得类似结果 。二、 凝胶图像分析指标的选择 :
 
图像分析中的光密度测定是基于对图像象素的数字化处理 , 所选条带的光密度定量
资料根 据其体积进 行计算。     条带定 量依赖于
 
所选 区域的 象素量 及测定 点的密度 ,  结果 以
 
光密度总量 (体积 ) 表示 。 在凝胶图像分析软件中 , 光 密度定量分析的指 标有 体积 , 面 积 , 高度 , 体积百分 比及分子量等。 体积或体积百分比是 所定义体积 区域内的光密度总量 或总
 
量百 分比 , 面积则指所定义 区域内 每个峰值的面积 , 高度是在 0 ~ 25 5 灰度范围中的**大光密度量 。 实验结果表明 , 体积及体积百分比与梯度起始模板有 良好的相关关 系 , 能客观
 
反映凝胶中的 D N A  含量 ,  是 一个较好的定
 
量指标 ;  由于琼脂糖电泳后的 P C R 产物是立
 
体存在于 凝胶中 ,  显然用面 积或 高度不能真
 
实反映 D N A 含量 ; 分子 量对电泳位置有一定意义 , 在有 M a r ek r 及阳 性对照情况下 , 有
 

助于排除非特异性条带[j6 。三、 方法学评价 :
选 择合适的 P C R  循环次数一 常规琼脂
 
糖 电泳 ,  E B 染色 ~ 凝胶图像光密度分析~ 定
 
量检测等 系列工作表明该法有以下特点 :   1.
 
操作简便 , 快速 。 除常规 P C R 外 , 仅需用 软件定量核酸 , 2 . 结果判断客观 , 可去除干扰和
 
非特异性条带 ;  3 .        保护 操作者。     操作过 程 中
 
操作者不与紫外线直接接触 ;  4.        结果可 长期
 
保存备查 ,  为临床结果 的前后对 比 及科研资
 
料 的积累提供便利的工具 ; 5 .       除对常规 P C R
 
产 物定量 ( H B V  D N A ,  T B一 D N A ) ,  也适用于
 
R T 一 P C R ( H C V  R N A ) 。
 
本法属 外参照定 量 P C R , 在每次检测 均应设置标准品 ; 不同厂家及不同批号的试剂 ,
 
因其扩增效率可能有差异 , 应调整 P C R 循环次数 ; 琼脂 糖电泳时应严 格取量 , 以 减少误