1 引言
凝胶成像系统图像分析法是进行 DNA定量的一种重要手段。该方法主要根据荧光染料与 DNA结合,经过激发后得到荧光信号的强弱与 DNA含量有关,含量越高, 荧光信号越强, 并具有一定的比例关系。荧光信号强弱可以通过
凝胶成像系统得到的凝胶图片上的 DNA电泳条带的灰度值来表示
[ 1] 。根据这一特点,在知道已知含量 DNA灰度值的情况下,通过测定未知含量的灰度值, 即可得出样本的 DNA含量。该方法由于操作简便、直接、节省 DNA分子等特点,得到广泛应用,特别是在进行少量 DNA的测定,
量 ,方法 1:DNA的含量 =(已知含量的 DNA的单位面积内的灰度值 )÷(D2000 6 μL上样量 750 bp 处的 DNA的单位面积内的灰度值 )×D2000 6 μL上样量 750 bp处的 DNA的含量;方法 2:根据已知D2000不同上样量 750 bp处的 DNA含量与所对应电泳条带平均灰度值建立的相关线性方程式 , 利用已知含量的 DNA所测定电泳条带单位面积灰度值计算出 DNA含量。将这两种计算所得的 DNA含量结果与已知 DNA含量做对比 ,观察哪一种计算方法所得的 DNA含量更接近真实值。
3 结果
如对酶切产物的定量较为适用。由于灰度值的数量变化在 0 ～255之间,变化范围较窄,因此需要寻找一个较佳的 DNA含量与灰度值具有相关性的范围。在此范围内,测定的灰度值应与 DNA的含量呈线性关系,且分辨率较高,使测定的 DNA含量更加准确。本研究拟对此 DNA检测范围进行探讨。
2 实验材料和方法
2.1 DNA电泳
3.1 不同组别不同含量 DNA的琼脂糖凝胶电泳结果
结果见图 1。
图 1A 组(1)电泳结果, 含量依次从低到高
分成 3组进行 DNA电泳。 (1)取已知含量的质粒 DNA稀释成 968 ng、726 ng、484 ng、242 ng、121 ng、60.5 ng、24.2 ng、12.1 ng, (2)将 D2000 marker (购自天佳公司 )以不同含量上样, 为 1 μL、2 μL、3
μL、4 μL、5 μL、6 μL、12 μL、18 μL。其中 750 bpDNA
6 μL的含量为 100 ng。 (3)在同一块琼脂糖凝胶将
D2000 marker以 2 μL、4 μL、6 μL、12 μL、上样, 同时将已知含量 DNA稀释成不同含量 (28 ng、56 ng、112 ng、140 ng上样 )。上述 DNA行 1%琼脂糖凝胶电泳 ,其中琼脂糖内含有 0.5 μg/ml的溴化乙啶。
2.2 DNA电泳结果的获得与分析
利用
凝胶成像系统对 DNA琼脂糖凝胶电泳结果进行观察 ,并拍照。利用 ImageJ软件对每条电泳条带进行图像分析
[ 2] , 测定相同面积内 (每条带测定的像素数一样 )的平均灰度值。利用 Excel软件对DNA含量和电泳条带平均灰度值进行相关性分析 。
图 1B 组(2)电泳结果, 含量依次从低到高
图 1C 组(3)电泳结果, 含量依次从低到高
图 1 不同含量 DNA的琼脂糖凝胶电泳的结果
266 中G体视学与图像分析 2008年 第 13 卷 第 4 期
3.2 DNA含量与灰度值之间的线性关系分析结果
对图 1A、1B所得的每条电泳带 ,根据测定的灰度值和相应的 DNA进行相关性分析 ,并求得线性方程。结果见图 2。
图 2A 图 1A电泳结果的图像获得的各电泳带的灰度值
与 DNA含量的相关性分析
图 2B 图 1A电泳结果的图像 DNA含量为 484 ng、242ng、
121ng、60.5 ng与相应各电泳带的灰度值的相关性分析
图 2D 图 1B电泳结果图像获得的 3— 7电泳带的 750 bp 处灰度值与相应 DNA含量的相关性分析
图 2 DNA含量与灰度值之间的线性关系分析
3.3 未知 DNA含量的计算结果
对图 1C利用 1—3的电泳条带的 750 bp的灰度值与已知 DNA含量之间建立的线性关系,根据这个线性关系,利用 5—8电泳条带所得的灰度值计算出相应 DNA含量。结果显示通过线性关系方程计算的DNA含量比直接针对某一已知 DNA含量的正比关系计算的 DNA含量更接近实际值。结果见图 3及表 1。
表 1 利用 DNA电泳条带的灰度值计算 DNA 的含量与实际含量
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DNA含量(ng) |
泳道 5 |
泳道 6 |
泳道 7 |
泳道 8 |
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方法 1 |
56.06 |
74.96 |
108.46 |
118.25 |
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方法 2 |
30.30 |
61.53 |
113.80 |
123.58 |
|
实际值 |
28.00 |
56.00 |
112.00 |
140.00 |
图 2C 图 1B电泳结果的图像获得的各电泳带的
750bp处灰度值与相应 DNA含量的相关性分析
图 3 图 1C电泳结果的图像获得的 1— 3电泳带的
灰度值与 DNA含量的相关性分析
4 讨论
在一些分子生物学实验过程中, 如质粒酶切, 基因片段与载体的连接、基因转染等往往需要对操作的 DNA分子进行定量。 DNA分子定量方法很多 , 并在不断发展中
[ 3] 。其中建立在荧光 DNA分析基
2008 年 第 13卷 第 4 期 杜珍武等:应用
凝胶成像分析系统定量测定 DNA含量的检测范围 267
础上的
凝胶成像分析系统由于操作简便、直接、节省DNA分子等特点,得到广泛应用。
利用凝胶成像系统进行 DNA含量测定 ,主要根据 DNA条带灰度值与 DNA含量成一定的相关性。采用已知的 DNAMarker含量与相应的灰度值来估算在同一凝胶上的未知的 DNA含量
[ 4] 。由于凝胶成像系统检测的电泳条带的灰度值在 0—255之间 , 当含量超过或低于一定含量时, 虽然含量相差很多 , 但相应的灰度值没有显著的差异, 使测定的 DNA含量与实际值相差很多。所以在进行 DNA定量时要求所测得的灰度值与相对应的 DNA含量处于一个高度分辨区。
本研究通过对凝胶电泳图像上的 DNA灰度值与 DNA含量的相关性分析结果表明:(1)DNA灰度值与 DNA含量呈正相关关系 , 但不成正比关系。(2)DNA灰度值与 DNA含量在一定范围内呈现良好的线性关系。在图 1A的电泳图像 DNA含量为
484 ng、242 ng、121 ng、60.5 ng时, 而在图 1B的电泳图像 DNA含量为 50ng、66.8 ng、83.5 ng、100ng、200 ng时, 与相应的灰度值可以建立良好线性关系 R
2 为 0.9971。根据这种线性关系 , 可以判断出同一凝胶电泳图 DNA的检测范围。 (3)应用已知含量DNA灰度值与含量在一定范围内呈现良好的线性关系可以较准确地计算出同一凝胶电泳图谱上未知
DNA的含量 , 但需要未知含量 DNA的灰度值处于已知建立良好线性关系不同浓度 DNA相对应的灰度值之间。
5 结论
利用凝胶成像系统进行 DNA含量测定 ,需要明确测定的 DNA含量范围, 在这一范围内 DNA含量与灰度值成良好的线性关系。 通过对已知含量DNA灰度值与 DNA含量之间能够建立良好线性关系的 DNA范围的判定, 可以明确在同一凝胶图像上未知含量 DNA的检测范围, 并根据建立的线性关系 ,计算出未知含量 DNA的含量。
