在一些分子生物学实验过程中, 如质粒酶切, 基因片段与载体的连接、基因转染等往往需要对操作的 DNA分子进行定量。 DNA分子定量方法很多 , 并在不断发展中。其中建立在荧光 DNA分析基础上的
凝胶成像分析系统由于操作简便、直接、节省DNA分子等特点,得到广泛应用。
利用
凝胶成像系统进行 DNA含量测定 ,主要根据 DNA条带灰度值与 DNA含量成一定的相关性。采用已知的 DNAMarker含量与相应的灰度值来估算在同一凝胶上的未知的 DNA含量
[ 4] 。由于
凝胶成像系统检测的电泳条带的灰度值在 0—255之间 , 当含量超过或低于一定含量时, 虽然含量相差很多 , 但相应的灰度值没有显著的差异, 使测定的 DNA含量与实际值相差很多。所以在进行 DNA定量时要求所测得的灰度值与相对应的 DNA含量处于一个高度分辨区。
本研究通过对凝胶电泳图像上的 DNA灰度值与 DNA含量的相关性分析结果表明:(1)DNA灰度值与 DNA含量呈正相关关系 , 但不成正比关系。(2)DNA灰度值与 DNA含量在一定范围内呈现良好的线性关系。在图 1A的电泳图像 DNA含量为484 ng、242 ng、121 ng、60.5 ng时, 而在图 1B的电泳图像 DNA含量为 50ng、66.8 ng、83.5 ng、100ng、200 ng时, 与相应的灰度值可以建立良好线性关系 R
2 为 0.9971。根据这种线性关系 , 可以判断出同一凝胶电泳图 DNA的检测范围。 (3)应用已知含量DNA灰度值与含量在一定范围内呈现良好的线性关系可以较准确地计算出同一凝胶电泳图谱上未知DNA的含量 , 但需要未知含量 DNA的灰度值处于已知建立良好线性关系不同浓度 DNA相对应的灰度值之间。
利用
凝胶成像系统进行 DNA含量测定 ,需要明确测定的 DNA含量范围, 在这一范围内 DNA含量与灰度值成良好的线性关系。 通过对已知含量DNA灰度值与 DNA含量之间能够建立良好线性关系的 DNA范围的判定, 可以明确在同一凝胶图像上未知含量 DNA的检测范围, 并根据建立的线性关系 ,计算出未知含量 DNA的含量。
